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【实验课堂】常用固定剂
2017-12-25 13:49:13  来自:天津市第三中心医院

  固定的意义一是停止细胞中的生化反应,固定其中的各种生化物质状态,防止分解;二是固定细胞形态,防止其变形或破裂。

  固定剂的分类

  固定剂分为醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)、醇类(常用乙醇)、其它(丙酮)。

  作用机制及用途

  1.醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛):

  (1)4%中性甲醛:

  原理:形成分子间的交联,影响蛋白构型而使之固定。

  用途:病理科用于诊断的病理组织常用此法固定。配制成10%中性甲醛(福尔马林) 。

  优点:形态结构保存好,且穿透性强,组织收缩少。

  缺点及注意事项:

  ①甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;因此缩短固定时间,降低固定温度(4°C),组织块不宜过厚。

  ②分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,可造成假阴性的染色结果。切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

  (2)戊二醛

  原理:对于蛋白质、核酸、多糖及细胞内微管、滑面内质网、纺锤丝、胞饮小泡、和细胞基质固定良好。

  用途:电镜细胞化学研究。

  优点:穿透力强,可达4mm/h;固定后可在4度冰箱长期保存(数周-数月);保存细胞微细结构效果好。

  缺点:

  ①对脂肪不起固定作用;

  ②不稳定,易氧化。

  (3)多聚甲醛

  原理:通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能集团,使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2-)蛋白质不再发生改变,保存原位。

  用途:4%的多聚甲醛可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。1%的多聚甲醛可用于流式细胞术标本的固定。

  优点:对组织穿透性好,组织收缩小,对大多数抗原物质保存较好,特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。

  缺点:配制方法繁琐,需要加热及长时间搅拌。

  2.醇类(常用乙醇)

  (1)乙醇

  原理:高渗透的小分子非极性物质,其可以迅速渗透到细胞内部,固定微细结构,如糖蛋白、白蛋白,渗透力强。

  用途:95%的乙醇可用于细胞爬片的固定;70%的乙醇可用于流式细胞检测样本的固定。

  优点:穿透性强、抗原性保存好。

  缺点:

  ①95%乙醇脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而固定时间不宜过长(2小时内)。

  ②乙醇使蛋白变性程度轻,固定后蛋白可再溶解,在染色中孵育时间长的情况下,抗原可流失,并减弱反应强度。

  3.其它

  (1)丙酮

  原理:溶解膜磷脂,所有的脂质双层(胞膜、核膜、细胞器膜等)将被破坏,但蛋白和多糖类不受影响。

  用途:可用于细胞爬片的固定

  优点:

  ①丙酮兼有脱水的作用,固定后不需脱水

  ②可溶胞膜、核膜,如果染胞浆或胞核可不用或少用细胞打孔剂。

  缺点:

  ①丙酮的挥发性很强,有毒,可对中枢神经系统产生抑制。

  ②需提前预冷处理,固定后结构稍不完整。

  ③如果用孔板做,丙酮会将孔板溶掉。

  (2)Bouin固定液:非常适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀,收缩很少,不会使组织变硬变脆。需现配现用。

  (3)Carnoy固定液:穿透能力强,可很好的固定细胞质和细胞核,非凡适用于固定外膜致密的组织,也适用于糖原及尼氏小体的固定。

  (4)Zenker固定液:经此液固定的标本,细胞核和细胞质染色颇为清楚,但成本较高且需非凡处理汞。该固定液要避免接触阳光,以免引起化学变化而失效。

  (5)乙醚(或三氯甲烷)与乙醇等量混合对组织穿透性极强,即使涂片上含较多的黏液,固定效果仍较好,是理想的细胞固定液。

  以上是对各种固定剂进行简单汇总,希望各位科研人员在实验中理清思路、避免混淆,根据不同实验选择合理的固定液。

  (刘辉)

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